報(bào)告基因法是將報(bào)告基因編碼的序列與基因表達(dá)序列融合或者與其他目的基因融合形成重組蛋白，通過報(bào)告基因產(chǎn)物的表達(dá)來顯示目的基因的表達(dá)調(diào)控。
基于熒光素酶的報(bào)告基因與β-半乳糖苷酶 (β-Gal)、葡萄糖醛酸酶 (GUS) 、綠色熒光蛋白 (GFP) 、分泌型堿性磷酸酶 (SEAP) 報(bào)告基因具有獨(dú)特的優(yōu)勢，它的優(yōu)勢在于：
② 內(nèi)源性低，哺乳動(dòng)物無內(nèi)源性表達(dá)和其檢測不受細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)影響的特點(diǎn)；
③ 無激發(fā)光的非特異性干擾，信噪比較高；
④ 檢測范圍廣，大于7個(gè)數(shù)量級。
圖1。(A)，I型干擾素在用ISRE驅(qū)動(dòng)的熒光素酶穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK 293細(xì)胞中誘導(dǎo)熒光素酶表達(dá)。(B)，抗-IL-6/抗-IL-6R mAbs抑制用SIE驅(qū)動(dòng)的熒光素酶穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的DS-1細(xì)胞中IL-6誘導(dǎo)的熒光素酶表達(dá)。(C)，抗VEGF/抗VEGFR2 mAb抑制用VEGFR2和NFAT響應(yīng)性熒光素酶穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK 293細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)。(D)，CHO細(xì)胞被膜錨定的抗CD3 scFv和PD-L1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，而Jurkat細(xì)胞被PD-1和NFAT反應(yīng)性熒光素酶穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。CHO細(xì)胞上的抗 CD3 scFv交聯(lián)并激活Jurkat細(xì)胞上的CD3，導(dǎo)致NFAT控制的熒光素酶的表達(dá)，但CHO細(xì)胞上的PD-L1與Jurkat細(xì)胞上的PD-1相互作用，抑制熒光素酶的表達(dá)，而抗PD-1/anti-PD-L1 mAbs阻斷PD-1和PD-L1相互作用，導(dǎo)致熒光素酶表達(dá)抑制的逆轉(zhuǎn)。(E)，Jukat細(xì)胞用FcγRIIIa-FcεRIγ嵌合體和用于mAb的ADCC的NFAT響應(yīng)熒光素酶穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。腫瘤抗原之間的相互作用mAbs和Fab以及mAbs的Fc和嵌合體的胞外FcγRIIIa部分有助于嵌合體的交聯(lián)，由嵌合體的胞內(nèi)FcεRIγ部分介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致NAFT控制的熒光素酶的表達(dá)。(F)，H322細(xì)胞用與熒光素酶C端融合的Shc蛋白和與熒光素酶N端融合的Grb2蛋白穩(wěn)定轉(zhuǎn)染用于抗EGFR mAb。由EGF誘導(dǎo)的EGFR的激活、二聚化和磷酸化依次募集Shc和Grb2，并且這兩種蛋白質(zhì)的接近重構(gòu)了熒光素酶，而抗EGFR mAbs消除了由EGF誘導(dǎo)的熒光素酶生物活性。
下面簡單介紹報(bào)告基因法檢測抗HER2單克隆抗體ADCC生物學(xué)活性的方法構(gòu)建。
構(gòu)建FcγRⅢ表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-hFcγRⅢa和報(bào)告基因質(zhì)粒pcDNA3.1-NFAT-RE-luc，并轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞，接種密度為2.5×105～4×105個(gè)·mL-1，2～3d傳代，最高細(xì)胞密度不應(yīng)超過2×106個(gè)·mL-1；傳代培養(yǎng)基為RPMI 1640+10%FBS。電轉(zhuǎn)參數(shù)如下：電轉(zhuǎn)體積為100μL；細(xì)胞數(shù)目為2×106個(gè)·mL-1；質(zhì)粒用量為10μg；電轉(zhuǎn)條件為1350V，10ms，3次。電轉(zhuǎn)后的Jurkat細(xì)胞于6孔板培養(yǎng)，每孔培養(yǎng)基為2mL。
效應(yīng)細(xì)胞株的篩選
轉(zhuǎn)染24h或48h后加入篩選壓力，以G418作為單轉(zhuǎn)pcDNA3.1-hFcγRⅢa的選擇壓力劑，篩選質(zhì)量濃度為500μg·mL-1；以嘌呤霉素作為單轉(zhuǎn)pcDNA3.1-NFAT-RE-luc的選擇壓力劑，篩選質(zhì)量濃度為1.0μg·mL-1；對于細(xì)胞表面的hFcγRⅢa分子，采用流式分析的方法進(jìn)行克隆鑒定和篩選。200g離心5min收集1×105個(gè)細(xì)胞，以PBS洗滌1次，200g離心5min后，加入1μg·mL-1FITC標(biāo)記remicade，4℃孵育1h，再以PBS洗滌3次，每次200g離心5min，最后以200μL PBS重懸細(xì)胞進(jìn)行流式檢測。通過NFAT通路激活因子PMA和離子霉素共刺激的方法檢測NFAT-RE-luc報(bào)告基因信號(hào)高的克隆，不同克隆每孔加入200μL含有0.1μmol·L-1PMA和1μmol·L-1離子霉素的細(xì)胞培養(yǎng)基(含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基)刺激過夜，以僅加200μL細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞孔作為陰性對照進(jìn)行熒光信號(hào)比較篩選。
靶細(xì)胞的選擇
流式細(xì)胞術(shù)檢測人乳腺癌細(xì)胞系SKBR3、BT474及MCF7表面HER2表達(dá)量差異，經(jīng)FlowJo7.2.5軟件分析可知，這3株細(xì)胞表面HER2蛋白的表達(dá)量高低為SKBR3>BT474>MCF7。ADCC試驗(yàn)成功的重要條件之一就是特異的HER2+靶細(xì)胞，在這幾個(gè)HER2+細(xì)胞株中，SKBR3和BT474表面均高表達(dá)HER2抗原，明顯優(yōu)于MCF7。
抗體濃度范圍選擇、效靶比的選擇、誘導(dǎo)時(shí)間的選擇
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基于保證劑量效應(yīng)四參數(shù)曲線平臺(tái)及保證誘導(dǎo)效果的考慮，最終選擇起始稀釋工作濃度為4000ng·mL-1，1∶4梯度稀釋作為檢測抗HER2單抗ADCC生物學(xué)活性時(shí)的試驗(yàn)方案。從不同效靶比得到的不同ADCC試驗(yàn)FI值并結(jié)合考慮EC50值，效靶比為15∶1時(shí)能有效誘導(dǎo)ADCC活性并得到最大的FI值。ADCC誘導(dǎo)倍數(shù)隨著不同誘導(dǎo)時(shí)間變化明顯，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為20和24h時(shí)可得到較大誘導(dǎo)倍數(shù)，考慮到工作效率等因素，選擇誘導(dǎo)時(shí)間為20h。
方法應(yīng)用
以原研HER2單抗為參比品，選取不同類型的抗HER2單抗1、單抗2，運(yùn)用選定的報(bào)告基因法，分別進(jìn)行ADCC活性測定。單抗1作用于HER2胞外的第2個(gè)結(jié)構(gòu)域，主要通過阻斷HER2的二聚化發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)。單抗2是針對HER2靶點(diǎn)的新型抗體-藥物偶聯(lián)物(antibody drug conjugates,ADC)，其不僅具有原研抗HER2單抗類似的生物學(xué)活性，還能通過其偶聯(lián)的化學(xué)藥物的釋放特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，不同類型的HER2單抗在本實(shí)驗(yàn)中均呈現(xiàn)較好的劑量效應(yīng)曲線，說明本方法可應(yīng)用于不同類型HER2靶點(diǎn)單抗ADCC效應(yīng)的檢測與比較。
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參考文獻(xiàn)
[1] Wang, L. , Yu, C. , & Wang, J. . (2019). Development of reporter gene assays to determine the bioactivity of biopharmaceuticals. Biotechnology Advances, 107466.
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